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近日，南方科技大学生命科学学院讲席教授陈炜研究团队在学术期刊 Nature Communications 上发表题为“Specific multivalent molecules boost CRISPR-mediated transcriptional activation”的研究论文。这项研究开发了基于 IDR（Intrinsically disordered region）及 MD（Modular domain）的高效 CRISPRa（CRISPR activation）转录激活系统，并揭示了转录过程中多价相互作用的调控机制。
CRISPR-Cas 系统已被广泛应用于基因编辑、转录和翻译调控。基于 CRISPR-Cas 系统，通过融合不同的转录激活元件，多种 CRISPRa 转录激活工具已经被开发。CRISPRa 转录激活系统能够特异性的调节靶基因表达，且不会造成基因组损伤及序列突变，是基因治疗潜在的优秀工具。然而，高效率的 CRISPRa 转录激活系统通常需要多个转录激活元件，从而导致其难以通过 AAV 病毒系统递送，极大地影响了其在基因治疗中的应用。近年来，相分离在转录调控中的功能已经逐渐被广泛关注。IDR 已被发现于多种转录调控元件，且能够促进基因的转录激活，为开发高效的 CRISPRa 转录激活系统提供了新的研究方向。
图1 基于 dCas9-VP64-IDR/MD 的 CRSIPR 转录激活
在该研究中，研究人员将 dCas9-VP64 与不同的 IDR 相融合，并测定 IDR 对 CRISPRa 融合蛋白 dCas9-VP64 转录激活的影响（图1）。研究发现，在12种IDR中，有7种可以增强 dCas9-VP64 转录激活，且 dCas9-VP64-FUS 对于不同靶向基因均有较好的激活效果。因此，研究人员后续研究集中在此融合蛋白，并进一步验证了其转录激活的特异性。通过对 FUS IDR 的多价相互作用缺陷突变体的研究，研究人员发现多价相互作用对转录激活的增强至关重要。然而，后续通过对 dCas9-VP64-FUS 和无增强效果的 dCas9-VP64-TDP43 进行活细胞成像观察及荧光漂白恢复实验，发现转录激活的增强并不与液-液相分离相偶联。进一步的免疫共沉淀实验发现 dCas9-VP64-FUS 及 dCas9-VP64-TDP43 均可以招募 BAF 染色质重塑复合体的核心蛋白 BRG1，但只有 dCas9-VP64-FUS 能招募 RNA 聚合酶II并增强转录。
MD 是另一种可以介导相分离的多价分子，先前的研究并未将其与转录激活相联系。有趣的是，研究人员发现直接将 MD 与 dCas9-VP64 融合对其转录激活没有显著性影响，但将其与 dCas9-VP64-FUS 融合可以大幅度增强后者的转录激活功能（图1），说明 IDR 和 MD 组合能够协同放大转录激活的效果。通过利用 dCas9-VP64-IDR/MD 激活子对含有不同数量重复靶向序列的报告基因进行转录激活实验，研究人员进一步发现过量的顺式-反式相互作用将抑制转录激活，稳健的转录激活需要最佳的顺式-反式相互作用。
为了进一步增强 CRISPRa 转录激活系统对基因转录的激活效果，研究人员将 CRISPRa 转录激活融合蛋白同时靶向基因的增强子和启动子，发现靶向增强子-启动子对能显著提升转录激活效率。然而，类似的结果并没有在 dCas9-VP64 中观察到，暗示 IDR/MD 在介导增强子-启动子协同中具有不可或缺的作用。最后，研究人员通过 ABI1-PYL1 化学诱导系统人为地构建增强子-启动子环，并发现其能进一步增强 CRISPRa 系统介导的转录激活（图2）。因此，本研究不仅开发了一个高效的基因转录激活平台，还为基因转录调控领域提供了重要见解。
图2 染色质相互作用增强CRISPRa转录激活
南方科技大学生命科学学院博士生陈瑞为论文的第一作者，陈炜讲席教授、崔欢欢研究副教授为论文的通讯作者，南方科技大学郑梅珍助理教授课题组参与了该研究，生命科学学院张明杰院士在课题发展和文章撰写过程中多次提供宝贵建议，其团队白冠华博士为荧光漂白恢复实验提供了技术支持。南方科技大学为论文第一单位。该研究得到国家重点研发计划、深圳市科创委、深圳市基因调控与系统生物学重点实验室等项目资助。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-51694-y
供稿：生命科学学院
通讯员：付文卿、陈瑞
主图：丘妍
编辑：曾昱雯
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