重磅！Nature发文，张恒团队揭示新型CRISPR–Cas系统的分子功能机制

发布时间: 2024-08-16 16:04:14 浏览次数 : 1078 来源:天津医科大学

细菌、古菌等微生物，是地球上历史最悠久的生物形式之一。在地球数十亿年变迁中，凭借各自的免疫系统，细菌等微生物与病毒互相厮杀、制衡、生存。其中，CRISPR – Cas系统是细菌和古菌抵抗病毒入侵的适应性免疫系统，研究并利用好这一免疫系统，可将其应用到人体细胞中，像电脑中的杀毒软件一样，清理人体中的病毒或对遗传病中的致病基因进行精准“敲除”。

今天，天津医科大学基础医学院生化系、天津市免疫学研究所张恒团队联合中国科学院武汉病毒所邓增钦团队，在Nature期刊发表了题为"Structural basis for the activity of the type Ⅶ CRISPR-Cas system"的研究论文，揭示了Ⅶ型 CRISPR – Cas系统的生物学功能和分子机理，也为更安全、更精准地治疗人类相关疾病提供了可能性。

根据Cas效应蛋白的不同，可将其分为2大类共七型。其中，第1类系统由多个效应蛋白与向导RNA组成复合体行使功能，包括Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅶ型;第2类系统由单个效应蛋白与向导RNA形成复合体，包括Ⅱ，Ⅴ和Ⅵ型。如Cas9、Cas12和Cas13分别为Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型系统的效应蛋白，是广泛应用的DNA和RNA编辑工具。目前，Ⅰ–Ⅵ型系统的功能和机制研究相对深入，然而，Ⅶ型作为一种候选CRISPR-Cas系统，其生物学功能和分子机理此前尚不清楚。

团队研究发现，与其它1类CRISPR系统的显著区别是，候选的Ⅶ型CRISPR复合体对核酸酶(Cas14)的招募依赖于底物RNA与crRNA序列的互补配对(图1)。细胞功能实验进一步证实，这一复合体能够序列特异性识别细胞内转录本，靶向敲低基因表达，并能够对抗噬菌体对宿主大肠杆菌的感染(图1)，是具有适应性免疫功能的真正CRISPR系统。底物RNA依赖的复合体组装使这一系统有可能被进一步开发成为高精准可编程的RNA靶向编辑工具。

图1 Ⅶ型CRISPR – Cas系统的RNA靶向识别与切割。a, Ⅶ型系统可特异性敲低红色荧光蛋白和卡那霉素抗性基因的表达;b, Ⅶ型系统可抵御RNA噬菌体MS2的感染;c, 核酸酶Cas14与Cas5-Cas7-向导RNA的结合依赖于靶点RNA的存在;d, Cas14的RNA酶活性。为阐明Ⅶ型CRISPR-Cas系统切割底物RNA的分子机制，并进一步探究其应用于基因编辑的可能性，团队对宏基因组来源的Ⅶ型系统复合体进行了生化表征及结构解析，共得到7种不同功能状态的高分辨电镜结构(图2)。这一分子量超过500 kDa的复合体由7个Cas7蛋白、1个Cas5蛋白、4个Cas14蛋白以及crRNA和底物RNA构成(图2)。与其它CRISPR系统不同，Ⅶ型系统通过一种独特的核酸酶Cas14执行切割底物RNA活性，对单链和双链DNA无切割作用。Cas14在溶液中形成四聚体，具有Zn2+依赖的RNA内切酶及5'到3'外切酶活性。

图2 Ⅶ型CRISPR–Cas复合体底物结合状态I的密度图(a)和结构模型(b)

底物靶序列两侧的序列(protospacer flanking sequence，PFS)的存在往往限制了CRISPR工具对靶点的选择性。团队通过功能研究和结构验证，发现Ⅶ型系统区别于其它CRISPR – Cas系统的另一个特点是，3'-PFS对底物切割无影响，5'-PFS则可以通过增加Ⅶ系统复合体中Cas14的结合位点影响对RNA底物的切割。基于以上细胞功能、生物化学和结构生物学研究，团队较为深入的阐明了Ⅶ型系统的工作机理和结构基础(图3)。Ⅶ型系统的以上三个独特之处，使其有可能成为非常有潜力的新型RNA编辑工具。

图3 Ⅶ型CRISPR – Cas系统的工作机理

靶向RNA的CRISPR工具的一个主要特点是可编程性，它可以直接编辑或降解突变的mRNA，精准地纠正基因表达异常。与DNA编辑不同，RNA编辑不产生永久性基因改变，这减少了脱靶效应和潜在的副作用，使其更具安全性，为开发精准医疗提供了新方法。因此Ⅶ型CRISPR编辑工具对药物开发以及临床治疗具有巨大的潜在价值。综上，该研究首次对Ⅶ型CRISPR–Cas系统的功能进行了表征，深入阐明了这一系统独特的组装机制、底物RNA识别和切割模式，为基于Ⅶ型CRISPR系统的RNA操控工具在生物技术应用中的设计与开发奠定了基础。

天津医科大学张恒教授和武汉病毒所邓增钦研究员为论文的共同通讯作者。天津医科大学基础医学院杨洁博士、研究生李徐梓超、何秋秋、王枭燊、王童谣和武汉病毒所研究生唐晶晶为该论文共同第一作者。另外，天津医科大学基础医学朱宪彝班本科生张淑琴和刘志坤作为研究团队的重要成员，负责实验设计和结果分析，为研究的顺利进行作出了突出贡献。该研究得到了国家自然科学基金、天津市自然科学基金、中国科学院“百人计划”项目的支持。

张恒

基础医学院教授，卓越人才计划PI，博士生导师，国家优秀青年基金获得者。2020年9月加入天津医科大学，从事教学和科研工作。长期致力于微生物-宿主互作的蛋白质功能结构研究。实验室成立四年来，以通讯作者在Nature、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Chemical Biology、Nature Structural & Molecular Biology、Nature Communications等国际期刊发表论文10余篇。